RT-qPCR yog tsim los ntawm cov tshuab PCR zoo tib yam.Nws ntxiv cov tshuaj fluorescent (fluorescent dyes lossis fluorescent probes) rau cov txheej txheem PCR cov tshuaj tiv thaiv ib txwm muaj, thiab kuaj pom cov txheej txheem PCR annealing thiab txuas ntxiv nyob rau lub sijhawm raws li lawv qhov sib txawv luminescent mechanisms.Fluorescent teeb liab hloov nyob rau hauv nruab nrab yog siv los xam tus nqi ntawm cov khoom hloov nyob rau hauv txhua lub voj voog ntawm PCR.Tam sim no, feem ntau txoj kev yog fluorescent dye method thiab sojntsuam txoj kev.

Fluorescent dye method:
Qee cov fluorescent dyes, xws li SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, thiab lwm yam, tsis tawm lub teeb los ntawm lawv tus kheej, tab sis emit fluorescence tom qab khi rau qhov me me ntawm dsDNA.Yog li ntawd, thaum pib ntawm PCR cov tshuaj tiv thaiv, lub tshuab tsis tuaj yeem ntes cov teeb liab fluorescent.Thaum cov tshuaj tiv thaiv mus rau qhov kev sib txuas ntxiv (ob-kauj ruam txoj kev) lossis theem txuas ntxiv (txoj kev peb-kauj ruam), ob txoj hlua tau qhib rau lub sijhawm no, thiab DNA polymerase tshiab Thaum lub sij hawm strand synthesis, fluorescent molecules tau ua ke hauv dsDNA me zawj thiab emit fluorescence.Raws li tus naj npawb ntawm PCR cycles nce, ntau thiab ntau dyes ua ke nrog dsDNA, thiab cov teeb liab fluorescent kuj tseem txhim kho tsis tu ncua.Siv SYBR Green Ⅰ ua piv txwv.
Txoj kev sojntsuam:
Taqman sojntsuam yog feem ntau siv hydrolysis sojntsuam.Muaj ib pab pawg fluorescent ntawm 5′ kawg ntawm qhov kev sojntsuam, feem ntau yog FAM.Qhov kev sojntsuam nws tus kheej yog ib ntus ntxiv rau lub hom phiaj gene.Muaj ib pawg fluorescent quenching ntawm 3′ kawg ntawm fluorophore.Raws li lub hauv paus ntsiab lus ntawm fluorescence resonance zog hloov (Förster resonance zog hloov, FRET), thaum lub reporter fluorescent pab pawg neeg (pab fluorescent molecule) thiab cov quenching fluorescent pab pawg neeg (acceptor fluorescent molecule) Thaum lub excitation spectrum overlaps thiab qhov deb yog heev ze (7-10nm), lub fluorescent cov neeg txais kev pab cuam ntawm lub molecule, lub excitation molecule. molecule, thaum lub autofluorescence tsis muaj zog.Yog li ntawd, thaum pib ntawm PCR cov tshuaj tiv thaiv, thaum qhov kev sojntsuam yog dawb thiab tsis zoo nyob rau hauv lub cev, cov neeg sau xov xwm fluorescent pawg yuav tsis tawm fluorescence.Thaum annealing, primer thiab sojntsuam khi rau lub template.Thaum lub sijhawm txuas ntxiv, cov polymerase txuas ntxiv txuas ntxiv cov saw tshiab.DNA polymerase muaj 5′-3′ exonuclease kev ua.Thaum mus txog qhov kev sojntsuam, DNA polymerase yuav hydrolyze qhov kev sojntsuam los ntawm tus qauv, cais cov neeg sau xov xwm fluorescent los ntawm pawg quencher fluorescent, thiab tso tawm cov teeb liab fluorescent.Txij li thaum muaj kev sib raug zoo ib-rau-ib qho ntawm qhov kev sojntsuam thiab tus qauv, txoj kev sojntsuam yog qhov zoo tshaj rau txoj kev dye raws li qhov tseeb thiab qhov rhiab ntawm qhov kev xeem.

Daim duab 1 Txoj Cai ntawm qRT-PCR

Primer tsim
Cov ntsiab cai:

Cov primers yuav tsum tau tsim nyob rau hauv cheeb tsam kev txuag ntawm nucleic acid series thiab muaj qhov tshwj xeeb.

Nws yog qhov zoo tshaj plaws los siv cDNA ib ntus, thiab mRNA ib ntus kuj tau txais.Yog tias tsis yog, nrhiav cds cheeb tsam tsim ntawm DNA ib ntus.
Qhov ntev ntawm cov khoom lag luam fluorescent yog 80-150bp, qhov ntev tshaj plaws yog 300bp, qhov ntev primer feem ntau yog nyob nruab nrab ntawm 17-25 hauv paus, thiab qhov sib txawv ntawm cov dej ntws thiab cov dej hauv qab yuav tsum tsis txhob loj dhau.

Cov ntsiab lus G + C yog nruab nrab ntawm 40% thiab 60%, thiab 45-55% yog qhov zoo tshaj plaws.
Tus nqi TM yog nyob nruab nrab ntawm 58-62 degrees.
Sim kom tsis txhob primer dimers thiab self-dimers, (tsis txhob tshwm sim ntau tshaj 4 khub ntawm sib law liag complementary bases) hairpin qauv, yog unavoidable, ua ΔG<4.5kJ/mol* Yog tias koj tsis tuaj yeem xyuas kom meej tias gDNA tau raug tshem tawm thaum lub sij hawm thim rov qab huv, nws yog qhov zoo tshaj plaws los tsim cov primers ntawm intron * 3' kawg kom tsis txhob muaj kev nplua nuj nyob hauv cheeb tsam G / AT, tsis tuaj yeem hloov kho, tsis txhob muaj cov qauv ntawm G / AT. 2-3) primers thiab non-
tshwj xeeb Lub homology ntawm lub heterogeneously amplified sequence yog nyiam tsawg tshaj li 70% los yog muaj 8 complementary puag homology.
Database:
CottonFGD nrhiav los ntawm cov ntsiab lus
Primer tsim:
IDT-qPCR primer tsim

Fig2 IDT online primer tsim cuab yeej nplooj

Fig3 result page display
Tsim ntawm lncRNA primers:
lncRNA:tib cov kauj ruam li mRNA.
miRNA:Lub hauv paus ntsiab lus ntawm txoj kev qia-voj: Txij li tag nrho cov miRNAs yog luv luv ntawm txog 23 nt, kev tshawb pom ncaj qha PCR tsis tuaj yeem ua tau, yog li siv cov cuab yeej qia-loop sequence.Cov qia-loop sib lawv liag yog ib leeg-stranded DNA ntawm txog 50 nt, uas tuaj yeem tsim cov qauv plaub hau los ntawm nws tus kheej.3 'Qhov kawg tuaj yeem tsim los ua ib qho kev sib txuas ntxiv rau miRNA ib feem ntawm qhov tawg, tom qab ntawd lub hom phiaj miRNA tuaj yeem txuas mus rau lub voj voog kab ke thaum rov qab hloov dua siab tshiab, thiab tag nrho qhov ntev tuaj yeem ncav cuag 70bp, uas yog nyob rau hauv txoj kab nrog qhov ntev ntawm cov khoom amplified txiav txim los ntawm qPCR.Tailing miRNA primer tsim.
Amplification-specific detection:
Online moj tej tawg database: CottonFGD moj tej tawg los ntawm ib theem zoo sib xws
Kev tawg hauv zos: Xa mus rau kev siv Blast + los ua lub suab nrov hauv zos, linux thiab macos tuaj yeem tsim cov ntaub ntawv hauv zos ncaj qha, win10 system kuj tuaj yeem ua tiav tom qab txhim kho ubuntu bash.Tsim cov ntaub ntawv pov tseg hauv zos thiab tawg hauv zos;qhib ubuntu bash ntawm win10.
Daim ntawv ceeb toom: Upland paj rwb thiab hiav txwv kob paj rwb yog tetraploid cov qoob loo, yog li qhov tshwm sim ntawm moj tej tawg yuav feem ntau yog ob los yog ntau tshaj qhov sib tw.Yav dhau los, siv NAU cds los ua cov ntaub ntawv los ua cov moj tej tawg yog yuav pom ob homologous noob uas tsuas yog ob peb qhov sib txawv SNP.Feem ntau, ob homologous noob tsis tuaj yeem sib cais los ntawm primer tsim, yog li lawv raug kho zoo ib yam.Yog tias muaj qhov pom tseeb indel, cov primer feem ntau yog tsim los ntawm indel, tab sis qhov no yuav ua rau cov qauv thib ob ntawm primer Lub zog dawb ua rau siab dua, ua rau txo qis hauv amplification efficiency, tab sis qhov no yog kev zam.

Kev txheeb xyuas ntawm primer theem nrab qauv:
Cov kauj ruam:qhib oligo 7 → input template sequence → kaw sub-window → txuag → nrhiav primer ntawm template, nias ctrl + D los teem primer ntev → txheeb xyuas ntau yam theem nrab, xws li self-dimerization lub cev, heterodimer, hairpin, mismatch, thiab lwm yam. Ob daim duab kawg hauv daim duab 4 yog cov kev ntsuam xyuas ntawm cov primers.Qhov tshwm sim ntawm cov primer pem hauv ntej yog qhov zoo, tsis muaj qhov pom tseeb dimer thiab cov qauv hairpin, tsis muaj qhov txuas ntxiv txuas ntxiv, thiab tus nqi ntawm lub zog dawb yog tsawg dua 4.5, thaum lub nraub qaum primer qhia tau hais tias txuas ntxiv 6 lub hauv paus, thiab lub zog dawb yog 8.8;Tsis tas li ntawd, ib qho dimer loj dua tshwm sim ntawm 3′ kawg, thiab ib qho dimer ntawm 4 lub hauv paus sib law liag tshwm.Txawm hais tias lub zog pub dawb tsis siab, 3 ′ dimer Chl tuaj yeem cuam tshuam rau kev nthuav dav tshwj xeeb thiab kev ua haujlwm zoo.Tsis tas li ntawd, nws yog ib qho tsim nyog los xyuas cov hairpins, heterodimers, thiab tsis sib haum.

Fig3 oligo7 nrhiav pom tau
Amplification efficiency nrhiav tau:
Kev ua kom zoo dua ntawm PCR cov tshuaj tiv thaiv cuam tshuam rau PCR cov txiaj ntsig.Tsis tas li ntawd nyob rau hauv qRT-PCR, qhov kev ua kom zoo dua qub yog qhov tseem ceeb tshwj xeeb rau cov txiaj ntsig ntau.Tshem tawm lwm yam khoom, tshuab thiab cov txheej txheem hauv cov tshuaj tiv thaiv tsis zoo.Qhov zoo ntawm cov primers kuj muaj kev cuam tshuam zoo rau kev ua kom muaj zog ntawm qRT-PCR.Txhawm rau kom ntseeg tau qhov tseeb ntawm cov txiaj ntsig, ob qho tib si cov txheeb ze fluorescence kom muaj nuj nqis thiab qhov tseeb fluorescence quantification yuav tsum tau kuaj xyuas qhov ua tau zoo ntawm cov primers.Nws tau lees paub tias qhov ua tau zoo qRT-PCR amplification efficiency yog nruab nrab ntawm 85% thiab 115%.Muaj ob txoj hauv kev:
1. Txuj kev nkhaus:
a.Mix cDNA
b.Gradient dilution
c.qPCR
d.Linear regression equation los xam cov amplification efficiency
2. LinRegPCR
LinRegPCR yog ib qho kev pabcuam rau kev soj ntsuam ntawm lub sijhawm RT-PCR Cov Ntaub Ntawv, tseem hu ua quantitative PCR (qPCR) cov ntaub ntawv raws li SYBR Green lossis zoo sib xws chemistry.Qhov kev zov me nyuam siv cov ntaub ntawv kho tsis yog hauv paus, ua qhov kev kho lub hauv paus ntawm txhua tus qauv Cais tawm, txiav txim siab lub qhov rais-ntawm-linearity thiab tom qab ntawd siv cov kab rov tav kev txheeb xyuas kom haum rau txoj kab ncaj nraim los ntawm PCR cov ntaub ntawv teev.Los ntawm txoj kab nqes ntawm kab no, PCR efficiency ntawm txhua tus qauv yog xam.Qhov nruab nrab PCR efficiency ib amplicon thiab tus nqi Ct rau ib tus qauv yog siv los xam qhov pib concentration ib tus qauv, qhia nyob rau hauv arbitrary fluorescence units.Cov ntaub ntawv tawm tswv yim thiab tso tawm yog los ntawm Excel daim ntawv nthuav qhia.Tsuas yog tus qauv
sib tov yog yuav tsum tau, tsis muaj gradient
cov kauj ruam yuav tsum tau:(Mus Bole CFX96 ua piv txwv, tsis yog tshuab nrog ABI meej)
kev sim:nws yog tus qauv qPCR kev sim.
qPCR cov ntaub ntawv tso zis:LinRegPCR tuaj yeem paub txog ob hom ntaub ntawv tso tawm: RDML lossis quantification Amplification tshwm sim.Qhov tseeb, nws yog lub sijhawm tshawb nrhiav tus nqi ntawm lub voj voog tus lej thiab cov teeb liab fluorescence los ntawm lub tshuab, thiab qhov kev nthuav dav yog tau los ntawm kev tshuaj xyuas cov fluorescence hloov tus nqi ntawm cov kab hluav taws xob ua haujlwm.
Kev xaiv cov ntaub ntawv: Hauv txoj kev xav, tus nqi RDML yuav tsum siv tau.Nws yog kwv yees tias qhov teeb meem ntawm kuv lub computer yog qhov software tsis tuaj yeem paub txog RDML, yog li kuv muaj cov txiaj ntsig excel raws li cov ntaub ntawv qub.Nws raug nquahu kom ua qhov kev ntsuam xyuas ntxhib ntawm cov ntaub ntawv ua ntej, xws li kev tsis ua haujlwm ntawm kev ntxiv cov qauv, thiab lwm yam. Cov ntsiab lus tuaj yeem raug tshem tawm hauv cov ntaub ntawv tso tawm (ntawm chav kawm, koj tsis tuaj yeem rho tawm lawv, LinRegPCR yuav tsis quav ntsej cov ntsiab lus hauv qab no).

Fig5 qPCR cov ntaub ntawv xa tawm

Fig6 xaiv cov qauv neeg sib tw

Cov ntaub ntawv nkag:Qhib kev tsim nyog amplification results.xls, → qhib LinRegPCR → cov ntaub ntawv → nyeem los ntawm excel → xaiv tsis raws li qhia hauv daim duab 7 → OK → nyem txiav txim hauv paus

Fig7 cov kauj ruam ntawm linRegPCR cov ntaub ntawv nkag

Qhov tshwm sim:Yog tias tsis muaj kev rov ua dua, tsis tas yuav tsum muaj pawg.Yog tias muaj kev rov ua dua, kev ua pab pawg tuaj yeem hloov kho hauv cov qauv kev sib koom ua ke, thiab lub npe ntawm cov noob tau nkag mus rau hauv tus cim, thiab tom qab ntawd tib lub noob yuav raug muab faib ua pawg.Thaum kawg, nyem rau ntawm cov ntaub ntawv, export excel, thiab saib cov txiaj ntsig.Qhov kev ua kom zoo dua qub thiab R2 cov txiaj ntsig ntawm txhua qhov dej yuav tshwm sim.Qhov thib ob, yog tias koj faib ua pab pawg, qhov kho qhov nruab nrab amplification efficiency yuav tshwm sim.Xyuas kom meej tias qhov kev ua tau zoo ntawm txhua tus primer yog nruab nrab ntawm 85% thiab 115%.Yog hais tias nws loj heev los yog me me, nws txhais tau hais tias lub amplification efficiency ntawm primer tsis zoo.

Daim duab 8 Qhov tshwm sim thiab cov ntaub ntawv tso tawm

Kev sim txheej txheem:
RNA cov kev xav tau zoo:
Purity:1.72.0 qhia tias tej zaum yuav muaj cov isothiocyanate residual.Huv nucleic acid A260/A230 yuav tsum nyob ib ncig ntawm 2 .Yog hais tias muaj zog nqus ntawm 230 nm, nws qhia tau hais tias muaj cov organic tebchaw xws li phenate ions.Tsis tas li ntawd, nws tuaj yeem kuaj tau los ntawm 1.5% agarose gel electrophoresis.taw tes rau tus cim, vim hais tias ssRNA tsis muaj denaturation thiab molecular hnyav logarithm tsis muaj kev sib raug zoo, thiab qhov hnyav molecular tsis tuaj yeem hais kom raug.Concentration: Theoreticallytsis yogtsawg dua 100ng / ul, yog tias qhov concentration tsawg dhau, qhov purity feem ntau qis tsis siab

Daim duab 9 RNA gel

Tsis tas li ntawd, yog tias tus qauv muaj nuj nqis thiab RNA concentration siab, nws raug nquahu kom aliquot nws tom qab rho tawm, thiab dilute RNA mus rau qhov kawg concentration ntawm 100-300ng / ul rau rov qab transcription.Hauvtus txheej txheem ntawm rov qab transcription, thaum mRNA tau sau tseg, oligo (dt) primers uas tuaj yeem khi rau polyA tails yog siv rau kev thim rov qab, thaum lncRNA thiab circRNA siv random hexamer (Random 6 mer) primers rau thim rov qab ntawm tag nrho RNA Rau miRNA, miRNA-specific siv caj dab-looprs.Ntau lub tuam txhab tam sim no tau tsim cov khoom siv tshwj xeeb tailing.Rau txoj kev qia-voj, txoj kev tailing yog yooj yim dua, high-throughput, thiab reagent-txuag, tab sis Cov nyhuv ntawm qhov txawv miRNAs ntawm tib tsev neeg yuav tsum tsis txhob zoo li txoj kev qia-voj.Txhua cov khoom siv rov qab rov qab muaj qhov yuav tsum tau ua rau qhov concentration ntawm cov noob tshwj xeeb primers (stem-loops).Kev siv sab hauv siv rau miRNA yog U6.Nyob rau hauv tus txheej txheem ntawm qia-voj inversion, ib lub raj ntawm U6 yuav tsum tau thim rov qab cais, thiab pem hauv ntej thiab nram qab primers ntawm U6 yuav tsum tau ntxiv ncaj qha.Ob lub circRNA thiab lncRNA tuaj yeem siv HKGs raws li kev siv sab hauv.Hauvnrhiav cDNA,
Yog tias tsis muaj teeb meem nrog RNA, cDNA kuj yuav tsum zoo.Txawm li cas los xij, yog tias qhov kev ua tiav ntawm qhov kev sim tau ua tiav, nws yog qhov zoo tshaj plaws los siv cov noob siv sab hauv (Reference gene, RG) uas tuaj yeem paub qhov txawv ntawm gDNA los ntawm cds.Feem ntau, RG yog ib hom kev tu tsev., HKG) raws li qhia hauv daim duab 10;Lub sijhawm ntawd, kuv tau ua cov kua txiv hmab txiv ntoo khaws cia, thiab siv actin7 uas muaj introns ua ib qho kev siv sab hauv.Qhov luaj li cas ntawm cov khoom loj ntawm cov primer hauv gDNA yog 452bp, thiab yog tias cDNA tau siv los ua tus qauv, nws yog 142bp.Tom qab ntawd cov txiaj ntsig tau sim pom tias Ib feem ntawm cDNA tau kis los ntawm gDNA, thiab nws kuj tau ua pov thawj tias tsis muaj teeb meem nrog cov txiaj ntsig rov qab, thiab nws tuaj yeem siv los ua tus qauv rau PCR.Nws yog qhov tsis muaj txiaj ntsig los khiav agarose gel electrophoresis ncaj qha nrog cDNA, thiab nws yog ib pawg diffuse, uas tsis ntseeg.

Daim duab 10 cDNA nrhiav pom

Kev txiav txim siab ntawm qPCR cov xwm txheejfeem ntau tsis muaj teeb meem raws li cov txheej txheem ntawm cov khoom siv, feem ntau nyob rau hauv cov kauj ruam ntawm tus nqi tm.Yog tias qee cov primers tsis zoo thaum lub sij hawm tsim primer, uas ua rau muaj qhov sib txawv loj ntawm tus nqi tm thiab qhov theoretical 60 ° C, nws raug nquahu tias cDNA Tom qab cov qauv sib xyaw, khiav ib qho gradient PCR nrog primers, thiab sim kom tsis txhob teeb tsa qhov kub thiab txias tsis muaj bands raws li tus nqi TM.

Cov ntaub ntawv tsom xam

Txoj kev sib raug zoo fluorescence quantitative PCR ua txoj kev yog qhov pib raws li 2- Δ CT.Cov ntaub ntawv txheej txheem template.

Yam khoom:

Lub Sijhawm PCR Yooj Yim^TM -Taqman

Lub Sijhawm PCR Yooj Yim^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix rau thawj strand cDNA synthesis)

RT Easy II (Master Premix rau thawj strand cDNA synthesis rau qPCR)