Hauv kev sim qPCR, primer tsim kuj yog qhov txuas tseem ceeb heev.Txawm hais tias cov primers tsim nyog los yog tsis yog ze ze rau seb qhov kev ua kom pom kev ua tau zoo nce mus txog tus qauv, seb cov khoom lag luam amplified yog qhov tshwj xeeb, thiab seb qhov kev sim tau muaj.
Yog li yuav ua li cas kom qPCR primer specification zoo dua?High amplification efficiency?
Niaj hnub no, peb yuav coj koj los tsim qPCR primers ua ke, thiab cia qPCR primer tsim los ua ib qho kev paub zoo hauv kev sim.
Thaum tsim qPCR primers, feem ntau yuav tsum xyuam xim rau cov ntsiab lus hauv qab no: primers yuav tsum tau tsim nyob rau hauv introns ntau npaum li sai tau, cov khoom ntev yuav tsum yog 100-300 bp, tus nqi Tm yuav tsum ze li sai tau mus rau 60 ° C, thiab cov upstream thiab downstream primers yuav tsum ze li sai tau, thiab qhov kawg ntawm primer yuav tsum yog G los yog C, thiab lwm yam.
1. Tsim cov primers spanning introns
Thaum tsim qPCR primers, xaiv primers tsim nyob rau hauv introns tuaj yeem tiv thaiv gDNA template los ntawm amplified, thiab cov khoom yog tag nrho los ntawm amplification ntawm cDNA, yog li tshem tawm cov kev cuam tshuam ntawm gDNA paug.
2. Primer ntev
Qhov ntev primer feem ntau yog nyob nruab nrab ntawm 18-30 nt, thiab qhov ntev ntawm cov khoom amplification yuav tsum tau tswj ntawm 100-300 bp kom ntau li ntau tau.
Yog tias cov primer luv dhau, nws yuav ua rau tsis muaj qhov tshwj xeeb amplification, thiab yog tias nws ntev dhau lawm, nws yuav yooj yim tsim cov qauv theem nrab (xws li hairpin qauv).Yog tias cov khoom lag luam amplification ntev dhau lawm, nws tsis haum rau cov tshuaj tiv thaiv ntawm polymerase, uas yuav cuam tshuam rau kev ua haujlwm ntawm PCR amplification.
3. GC cov ntsiab lus thiab Tm tus nqi
GC cov ntsiab lus ntawm primers yuav tsum tau tswj ntawm 40% thiab 60%.Yog tias nws siab dhau los yog qis dhau, nws tsis tsim nyog rau kev pib cov tshuaj tiv thaiv.GC cov ntsiab lus ntawm cov pem hauv ntej thiab thim rov qab primers yuav tsum nyob ze rau tib yam thiaj li yuav tau txais tib yam Tm tus nqi thiab annealing kub.
Tus nqi Tm yuav tsum nyob nruab nrab ntawm 55-65 ° C kom deb li deb tau, feem ntau nyob ib ncig ntawm 60 ° C, thiab Tm tus nqi ntawm cov dej ntws thiab qis qis yuav tsum nyob ze li qhov ua tau, nyiam tsis tshaj 4 ° C.
4. Tsis txhob xaiv A ntawm 3′ kawg ntawm cov primer
Thaum 3' kawg ntawm cov primer tsis sib haum, muaj qhov sib txawv loj hauv kev sib xyaw ua haujlwm ntawm cov hauv paus sib txawv.Thaum lub hauv paus kawg yog A, nws tseem tuaj yeem pib sib txuas cov saw hlau txawm tias qhov tsis sib xws, thiab thaum lub hauv paus kawg yog T Thaum twg, qhov ua tau zoo ntawm kev sib tsoo induction yog txo qis heev.Yog li ntawd, sim zam kev xaiv A ntawm 3' kawg ntawm cov primer, thiab nws yog qhov zoo dua los xaiv T.
Yog hais tias nws yog ib qho kev sojntsuam primer, 5' kawg ntawm qhov kev sojntsuam tsis tuaj yeem yog G, vim tias txawm tias ib lub hauv paus G txuas nrog FAM fluorescent reporter pawg, G tuaj yeem tua cov teeb liab fluorescent tawm los ntawm pawg FAM, uas ua rau cov txiaj ntsig tsis zoo.tshwm.
5. Base faib
Kev faib tawm ntawm plaub lub hauv paus hauv primer yog qhov zoo dua random, zam ntau tshaj 3 sib law liag G lossis C ntawm 3′ kawg, thiab ntau dua 3 sib law liag.G lossis C yog ib qho yooj yim los tsim kev sib koom ua ke hauv cheeb tsam GC-nplua nuj ua ntu zus.
6. Lub primer tsim cheeb tsam yuav tsum tsis txhob complex theem nrab qauv.
Cov qauv thib ob tsim los ntawm ib txoj hlua ntawm cov khoom lag luam amplification yuav cuam tshuam rau kev ua tiav ntawm PCR.Los ntawm kev kwv yees seb puas muaj cov qauv thib ob hauv cov phiaj xwm ua ntej, sim zam cov cheeb tsam no hauv kev tsim cov primers.
7. Cov primers lawv tus kheej thiab nruab nrab ntawm cov primers yuav tsum sim kom tsis txhob sib law liag complementary bases.
Tsis muaj peev xwm tsis sib law liag 4 lub hauv paus complementarity ntawm primer nws tus kheej thiab primer.Lub primer nws tus kheej yuav tsum tsis txhob muaj kev sib txuas ua ke, txwv tsis pub nws yuav quav nws tus kheej los tsim cov qauv plaub hau, uas yuav cuam tshuam rau kev sib xyaw ua ke ntawm primer thiab cov qauv.
Kev sib txuas ntxiv tsis tuaj yeem muaj nyob nruab nrab ntawm cov dej ntws thiab cov dej hauv qab.Complementarity ntawm primers yuav tsim primer dimers, uas yuav txo tau PCR efficiency thiab txawm muaj feem xyuam rau kom muaj nuj nqis.Yog tias cov txheej txheem primer-dimer thiab hairpin tsis tuaj yeem zam tau, tus nqi △G yuav tsum tsis txhob siab dhau (yuav tsum tsawg dua 4.5 kcal / mol).
8. Cov primers amplify lub hom phiaj cov khoom.
Lub hom phiaj kawg ntawm qPCR nrhiav tau yog kom nkag siab txog qhov ntau ntawm cov hom phiaj.Yog tias tsis yog qhov tshwj xeeb amplification tshwm sim, qhov ntau yuav tsis raug.Yog li ntawd, tom qab cov primers tau tsim, lawv yuav tsum tau kuaj los ntawm BLAST, thiab qhov tshwj xeeb ntawm cov khoom raug muab piv rau hauv cov ntaub ntawv sib lawv liag.
Tom ntej no, peb coj tib neeg GAS6 (Growth ntes tshwj xeeb 6) gene ua piv txwv los tsim qPCR primers.
01 nug gene
Homo GAS 6via NCBI.Ntawm no, peb yuav tsum xyuam xim rau kev sib piv cov noob npe thiab hom kom ntseeg tau tias lawv zoo ib yam.
02 Nrhiav cov noob kab ke
(1) Yog hais tias lub hom phiaj sib lawv liag yog genomic DNA, xaiv thawj tus, uas yog cov genomic DNA ib ntus ntawm cov noob.
(2) Yog tias lub hom phiaj ua ntu zus yog mRNA, xaiv qhov thib ob.Tom qab nkag mus, nyem "CDS" hauv cov lus hauv qab no.Cov xim av keeb kwm yav dhau yog cov txheej txheem coding ntawm cov noob.
03 Design primers
Nkag mus rau Primer-BLAST interface
Nkag mus rau tus lej lej lossis cov kab ke hauv Fasta hom nyob rau sab laug sab saud, thiab sau rau hauv qhov tsis sib xws.

Nyem "Get primers" thiab NCBI yuav pop tuaj qhia koj tias qhov kev xaiv tsis zoo no yuav raug nthuav dav rau lwm qhov sib txawv.Peb tuaj yeem tshawb xyuas qhov sib txawv ntawm qhov sib txawv thiab xa mus rau qhov tsim nyog primer khub (raws li qhia hauv daim duab hauv qab no).Cov txheej txheem no yuav siv sij hawm kaum vib nas this los khiav.
Qhov kub thiab txias ntawm cov primer khub no yog nyob ib ncig ntawm 60 ° C.Raws li lub hom phiaj ntawm qhov kev sim, xaiv cov primers nrog qhov ntev me ntsis, qhov tshwj xeeb zoo thiab tsis tshua muaj kev ua tiav ntawm tus kheej ntawm primers rau qhov kev sim, thiab qhov kev vam meej yog siab heev!
04 Primer kev txheeb xyuas qhov tseeb
Qhov tseeb, ntxiv rau kev tsim cov primers, Primer-Blast kuj tuaj yeem ntsuas cov primers peb tsim peb tus kheej.Rov qab mus rau nplooj ntawv tsim primer, nkag mus rau sab saud thiab nqes dej primers peb tsim, thiab lwm yam tsis raug kho.Tom qab xa tawm, koj tuaj yeem pom tias khub ntawm primers tseem muaj nyob rau lwm cov noob.Yog tias tag nrho cov no tau tshwm sim ntawm cov noob peb xav kom nthuav dav, qhia tias qhov tshwj xeeb ntawm ob khub ntawm primers no zoo heev!(Piv txwv li, qhov no tsuas yog qhov tshwm sim ntawm cov lus nug primer!)

05 Primer kev txiav txim zoo
Dab tsi ntawm primer yog "zoo meej" primer uas sib txuas "kev ua kom muaj zog nce mus txog tus qauv", "cov khoom lag luam nthuav dav", thiab "cov txiaj ntsig kev sim ntseeg tau"?
Amplification efficiency

melting nkhaus
Qhov kev ua tau zoo ntawm cov primers nce mus txog 90% -110%, uas txhais tau hais tias qhov kev ua tau zoo ntawm kev nthuav dav yog qhov zoo, thiab qhov nkhaus melting muaj ib lub ncov thiab feem ntau Tm> 80 ° C, uas txhais tau hais tias qhov amplification tshwj xeeb yog qhov zoo.
 
Yam khoom:
Lub Sijhawm PCR Yooj Yim-SYBR GREEN I
Lub Sijhawm PCR Yooj Yim-Taqman