PCR yog qhov siv ntau tshaj nucleic acid amplification technology thiab yog dav siv vim nws rhiab heev thiab tshwj xeeb.Txawm li cas los xij, PCR yuav tsum tau rov ua cov thermal denaturation thiab tsis tuaj yeem tshem tawm cov kev txwv ntawm kev cia siab rau cov cuab yeej thiab cov cuab yeej siv, uas txwv tsis pub nws daim ntawv thov hauv kev sim tshuaj.

Txij li thaum xyoo 1990s, ntau lub chaw soj nstuam tau pib tsim cov tshuab ntsuas kub tsis tu ncua uas tsis tas yuav tsum tau thermal denaturation.Tam sim no lawv tau tsim lub voj-mediated isothermal amplification technology, strand hloov isothermal amplification technology, dov lub voj voog isothermal amplification technology, thiab nucleic acid sequence dependence.Isothermal amplification technology thiab lwm yam technologies. 

Loop-mediated isothermal amplification

Lub hauv paus ntsiab lus ntawm amplification yog raws li qhov tseeb hais tias DNA nyob rau hauv ib tug dynamic equilibrium lub xeev ntawm txog 65 ° C.Thaum twg cov primer yog puag-paired thiab txuas mus rau qhov sib ntxiv ntawm ob-stranded DNA, lwm txoj hlua yuav sib cais thiab dhau los ua ib leeg.

Thaum qhov kub thiab txias no, DNA siv 4 cov primers tshwj xeeb los tso siab rau cov strand-displacement DNA polymerase los ua cov synthesis ntawm strand-displacement DNA nws tus kheej-kho tsis tu ncua.

Ua ntej txiav txim siab txog 6 thaj chaw tshwj xeeb F3, F2, F1, B1, B2, B3 ntawm lub hom phiaj noob, thiab tom qab ntawd tsim 4 primers raws li 6 thaj chaw tshwj xeeb (raws li qhia hauv daim duab hauv qab no):

Lub pem hauv ntej puab primer (FIP) yog tsim los ntawm F1c thiab F2.

Lub nraub qaum sab hauv primer (BIP) yog tsim los ntawm B1c thiab B2, thiab TTTT yog siv los ua lub hauv nruab nrab.

Sab nrauv primers F3 thiab B3 yog feem ntau tsim los ntawm F3 thiab B3 cheeb tsam ntawm lub hom phiaj noob.

Nyob rau hauv LAMP cov tshuaj tiv thaiv, qhov concentration ntawm cov primer puab yog ob peb zaug ntawm cov primer txheej.Sab hauv primer yog thawj zaug ua ke nrog cov qauv strand los ua ke ib qho kev sib txuas ntxiv los tsim DNA ob txoj hlua.Tom qab ntawd, cov txheej txheem sab nrauv yog ua ke nrog cov qauv strand los tsim DNA ob txoj hlua.Nyob rau hauv qhov kev txiav txim ntawm BstDNA polymerase, lub complementary strand synthesized los ntawm lub puab primer yog tso tawm.Tom qab ib qho kev tshwm sim, cov hlua txuas ntxiv thaum kawg tsim ib qho DNA strand nrog lub dumbbell qauv.

Lub dumbbell qauv DNA ib leeg strand nws tus kheej yog siv los ua ib tug qauv mus txuas ntxiv tsim ib tug transitional qia-voj qauv DNA nrog qhib kawg.Cov primers sab hauv thiab sab nrauv coj cov kev hloov pauv ntawm qia-voj qauv DNA kom tsis tu ncua kev hloov pauv thiab txuas ntxiv cov tshuaj tiv thaiv, thiab thaum kawg tsim ntau cov qia-voj qauv nrog ntev ntev.DNA sib tov.

Qhov zoo thiab qhov tsis zoo ntawm lub voj-mediated isothermal amplification

Qhov zoo ntawm LAMP:

(1) Kev ua haujlwm siab ua haujlwm siab, uas tuaj yeem ua kom zoo dua 1-10 daim ntawv theej ntawm lub hom phiaj hauv 1h, thiab kev ua kom zoo dua qub yog 10-100 npaug ntawm PCR zoo tib yam.

(2) Lub sijhawm tshuaj tiv thaiv luv luv, qhov tshwj xeeb muaj zog, thiab tsis tas yuav tsum muaj cov cuab yeej tshwj xeeb.

Shortcomings ntawm LAMP:

(1) Cov kev cai rau primers yog tshwj xeeb yog siab.

(2) Cov khoom lag luam amplified tsis tuaj yeem siv rau cloning thiab sequencing, tab sis tsuas yog siv tau rau kev txiav txim.

(3) Vim nws muaj zog rhiab heev, nws yog ib qho yooj yim rau tsim aerosols, ua rau tsis muaj tseeb zoo thiab cuam tshuam rau qhov kev xeem.

Strand displacement amplification

Strand displacement amplification (SDA) yog ib qho hauv vitro isothermal DNA amplification txheej txheem raws li cov tshuaj tiv thaiv enzymatic thawj zaug los ntawm American kws tshawb fawb Walker hauv 1992.

Cov txheej txheem tseem ceeb ntawm SDA suav nrog kev txwv endonuclease, DNA polymerase nrog kev ua haujlwm hloov chaw, ob khub ntawm primers, dNTPs, thiab calcium thiab magnesium ions thiab tsis siv tshuab.

Lub hauv paus ntsiab lus ntawm strand displacement amplification yog raws li cov tshuaj hloov kho kev txwv endonuclease kev lees paub nyob rau ob qho kawg ntawm lub hom phiaj DNA.Lub endonuclease qhib qhov sib txawv hauv cov strand DNA ntawm nws qhov chaw lees paub, thiab DNA polymerase txuas ntxiv qhov sib txawv 3′ Xaus thiab hloov pauv DNA strand tom ntej.

Cov hloov ib leeg ntawm DNA tuaj yeem ua ke nrog cov primers thiab txuas mus rau ob txoj hlua los ntawm DNA polymerase.Cov txheej txheem no yog rov ua tsis tu ncua, kom lub hom phiaj sib lawv liag tau zoo amplified.

Qhov zoo thiab qhov tsis zoo ntawm strand displacement amplification technology

Qhov zoo ntawm SDA:

Lub amplification efficiency yog siab, lub sij hawm cov tshuaj tiv thaiv yog luv luv, qhov tshwj xeeb yog muaj zog, thiab tsis muaj tshwj xeeb cov cuab yeej yuav tsum tau.

Shortcomings ntawm SDA:

Cov khoom lag luam tsis sib xws, thiab qee cov khoom lag luam ib leeg thiab ob txoj hlua khi ib txwm ua nyob rau hauv lub voj voog SDA, thiab tailing yuav inevitably tshwm sim thaum kuaj pom los ntawm electrophoresis.

Rlub voj voog amplification

Rolling circle amplification (RCA) yog npaj los ntawm kev kos duab ntawm txoj kev luam DNA ntawm cov kab mob pathogenic los ntawm dov lub voj voog.Nws yog hais txog kev siv ib leeg-stranded voj DNA raws li ib tug template ntawm qhov kub thiab txias, thiab tshwj xeeb DNA polymerase (xws li Phi29) ) Nyob rau hauv qhov kev txiav txim ntawm dov lub voj voog DNA synthesis kom ua tiav lub amplification ntawm lub hom phiaj noob.

RCA tuaj yeem muab faib ua linear amplification thiab exponential amplification.Kev ua haujlwm ntawm linear RCA tuaj yeem ncav cuag 10⁵sij hawm, thiab qhov ua tau zoo ntawm exponential RCA tuaj yeem ncav cuag 10⁹sij hawm.

Kev sib txawv yooj yim, raws li qhia hauv daim duab hauv qab no, linear amplification tsuas yog siv 1 primer, exponential amplification b muaj 2 primers.

Linear RCA tseem hu ua ib qho primer RCA.Lub primer khi rau cov DNA ncig thiab txuas ntxiv los ntawm kev ua ntawm DNA polymerase.Cov khoom yog ib qho linear ib strand nrog ib tug loj tus naj npawb ntawm repetitive sequences phav phav lub sij hawm ntev ntawm ib lub voj.

Txij li thaum cov khoom ntawm linear RCA yog ib txwm txuas nrog qhov pib primer, qhov yooj yim fixation ntawm lub teeb liab yog qhov zoo dua.

Exponential RCA, tseem hu ua Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), nyob rau hauv exponential RCA, ib tug primer amplifies cov khoom RCA, lub primer thib ob hybridizes nrog cov khoom RCA thiab txuas ntxiv, thiab qhov kev hloov yog twb khi rau cov khoom RCA Cov downstream primers txuas lub strand, thiab rov ua ib qho khoom ntxiv thiab hloov pauv.

Qhov zoo thiab qhov tsis zoo ntawm dov lub voj voog nucleic acid amplification

Qhov zoo ntawm RCA:

High rhiab heev, zoo meej thiab ua haujlwm yooj yim.

Qhov tsis zoo ntawm RCA:

Cov teeb meem keeb kwm yav dhau thaum kuaj pom.Thaum lub sij hawm RCA cov tshuaj tiv thaiv, qhov kev sojntsuam tsis muaj qhov ntsuas phoo thiab cov qauv DNA lossis RNA ntawm qhov kev sojntsuam tsis raug cai tuaj yeem tsim qee cov cim keeb kwm yav dhau. 

Nucleicacid sequence-based amplification

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) yog ib lub tshuab tshiab tsim los ntawm PCR.Nws yog ib qho txuas ntxiv thiab isothermal nucleic acid amplification coj los ntawm ib khub ntawm primers nrog T7 txhawb nqa ib ntus.Cov thev naus laus zis tuaj yeem nthuav dav tus qauv RNA txog li 109 zaug hauv li 2 teev, uas yog 1000 npaug siab dua li cov qauv PCR thiab tsis tas yuav muaj cov cuab yeej tshwj xeeb.

Cov thev naus laus zis no tau siv rau kev kuaj mob sai sai thaum nws tshwm sim, thiab ntau lub tuam txhab tam sim no siv cov qauv no hauv cov khoom siv tshawb nrhiav RNA.

Txawm hais tias RNA amplification tseem tuaj yeem siv rov qab hloov pauv PCR thev naus laus zis, NASBA muaj nws tus kheej qhov zoo: nws tuaj yeem ua tau raws li qhov ntsuas kub tsis tu ncua, thiab nws ruaj khov thiab raug dua li cov cuab yeej siv PCR.

Cov tshuaj tiv thaiv yog nyob ntawm 41 degrees Celsius thiab yuav tsum tau AMV (avian myeloblastosis virus) thim rov qab transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase thiab ib khub ntawm primers kom tiav.

Cov txheej txheem feem ntau suav nrog:

Lub pem hauv ntej primer muaj qhov sib ntxiv ntawm T7 tus txhawb nqa.Thaum lub sij hawm cov tshuaj tiv thaiv, lub pem hauv ntej primer khi rau RNA strand thiab yog catalyzed los ntawm AMV enzyme los ua ib tug DNA-RNA ob strand.

RNase H zom cov RNA hauv cov hybrid ob-strand thiab khaws cov DNA ib leeg.

Nyob rau hauv qhov kev txiav txim ntawm qhov thim rov qab primer thiab AMV enzyme, DNA ob chav strand uas muaj T7 cov txheej txheem txhawb nqa tau tsim.

Raws li qhov kev txiav txim ntawm T7 RNA polymerase, cov txheej txheem kev hloov pauv tau ua tiav thiab tsim ntau lub hom phiaj RNA.

Qhov zoo ntawm NASBA:

(1) Nws cov primer muaj T7 txhawb nqa ib ntus, tab sis txawv teb chaws ob-stranded DNA tsis muaj T7 txhawb nqa ib ntus thiab tsis tuaj yeem nthuav dav, yog li cov thev naus laus zis no muaj qhov tshwj xeeb thiab rhiab heev.

(2) NASBA ncaj qha koom nrog cov txheej txheem thim rov qab mus rau hauv cov tshuaj tiv thaiv amplification, ua kom lub sij hawm luv luv.

Disadvantages ntawm NASBA:

(1) Cov tshuaj tiv thaiv cov khoom muaj qhov nyuaj dua.

(2) Peb hom enzymes yuav tsum tau ua kom cov tshuaj tiv thaiv tus nqi siab dua.