Kev txheeb xyuas qhov ua tau zoo ntawm primers thiab sojntsuam nyob rau theem pib ntawm PCR reagents thiab txiav txim siab qhov tsim nyog cov tshuaj tiv thaiv zoo tshaj plaws yog qhov yuav tsum tau ua ua ntej txhawm rau ua kom muaj kev vam meej ntawm kev sim ua haujlwm.
Yog li yuav ua li cas peb thiaj li paub meej tias qhov kev sojntsuam primer nyob rau theem pib?
Cov cim tseem ceeb yog cov hauv paus ntsiab lus, kev nthuav dav nkhaus, ct tus nqi, kev ua kom pom kev ua haujlwm zoo, kev ntsuas qis qis, CV, thiab lwm yam.
Lub hauv paus
Lub hauv paus yog kab kab rov tav hauv PCR amplification nkhaus.Hauv thawj ob peb lub voj voog ntawm PCR amplification cov tshuaj tiv thaiv, cov teeb liab fluorescence tsis hloov ntau thiab ua ib txoj kab ncaj nraim.Txoj kab ncaj nraim no yog lub hauv paus.
Thaum kuaj xyuas PCR primer probes, ua tib zoo saib seb lub hauv paus yog theem.Lub purity ntawm primer sojntsuam concentration yuav cuam tshuam rau lub hauv paus, xws li ua rau lub hauv paus nce los yog poob.Lub hauv paus tseem yog qhov qhia tau zoo heev.
Amplification Curve
Lwm qhov intuitive qhia yog cov duab ntawm lub amplification nkhaus.Nws yog qhov zoo tshaj plaws kom muaj qhov nkhaus S-shaped kom tsis txhob muaj kev nthuav dav thib ob lossis lwm qhov txawv txav txawv txav.
Ct Tus nqi
Tus naj npawb ntawm cov voj voog sib raug rau qhov taw tes inflection los ntawm lub hauv paus mus rau qhov kev loj hlob exponential yog tus nqi Ct.
Rau tib tus qauv, qhov sib txawv primer probes ua rau sib txawv amplification curves, thiab tus nqi Ct sib raug yuav raug cuam tshuam los ntawm amplification efficiency thiab cuam tshuam degree.Hauv txoj kev xav, qhov tsawg dua tus nqi Ct ntawm primer sojntsuam peb xaiv, qhov zoo dua.
Amplification Efficiency
Ib txoj hauv kev txhim khu kev qha thiab ruaj khov tshaj plaws rau kev ntsuas PCR kev ua kom zoo dua qub yog cov qauv nkhaus, uas kuj tau lees paub los ntawm cov kws tshawb fawb.Txoj kev koom nrog ua cov qauv coj los tswj cov txheeb ze ntawm cov hom phiaj.Cov qauv no feem ntau yog ua los ntawm serial dilutions ntawm concentrated stock solutions, feem ntau siv yog 10-fold dilution.Siv cov qauv ntawm cov qauv diluted, siv cov qauv qPCR cov kev pab cuam los nthuav kom tau Cq tus nqi, thiab thaum kawg kos tus qauv nkhaus raws li qhov xav tau ntawm txhua tus qauv thiab tus nqi Cq sib raug kom tau txais cov kab zauv sib npaug Cq = -klgX0 + b, thiab qhov ua kom pom kev ua haujlwm zoo E = 10(-1 / k)-1.Thaum siv qPCR rau kev soj ntsuam kom muaj nuj nqis, qhov kev ua kom pom tseeb yuav tsum nyob hauv thaj tsam ntawm 90% -110% (3.6>k> 3.1).
Low-concentration Samples Detection
Thaum cov qauv concentration tsawg, qhov kev kuaj pom ntawm cov primer probes sib txawv.Peb xaiv 20 cov qauv uas tsis tshua muaj siab kom rov ua dua, thiab cov txheej txheem primer-probe nrog qhov ntsuas siab tshaj plaws yog qhov zoo tshaj plaws.
Coefficient ntawm Variation (CV)
10 cov qauv sib tw tuaj yeem kuaj pom nrog cov kev sojntsuam sib txawv raws li kab qauv ntawm cov reagent rau nucleic acid amplification nrhiav kom tau.
Quantitative Reagents:
Qhov tseeb
Qhov tseeb nyob rau hauv ib pawg yuav tsum tau raws li: tus coefficient ntawm variation (CV,%) ntawm tus nqi logarithmic ntawm qhov kev xeem concentration yog ≤5%.Thaum cov qauv concentration tsawg, cov coefficient ntawm kev hloov pauv (CV,%) ntawm lub logarithm ntawm qhov ntsuas pom yog ≤10%
Cov khoom zoo reagent:
Qhov tseeb
Qhov tseeb hauv ib pawg yuav tsum ua raws li:
(1) Coefficient ntawm variation ntawm tus nqi Ct (CV,%) ≤5%
Cov qauv tib yam yog kuaj nyob rau hauv parallel rau 10 lub sij hawm, thiab cov kev ntsuam xyuas yuav tsum zoo ib yam
Post lub sij hawm: Sep-18-2021
